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李劲松研究组利用“人造精子细胞”介导半克隆技术揭示重要的雄性印记调控区对胚胎发育的时序调节

        近期,中国科学院分子细胞科学卓越创新中心(生物化学与细胞生物学研究所)李劲松研究组在SCIENCE CHINA Life Sciences发表题为“Temporal regulation of prenatal embryonic development by paternal imprinted loci”的封面文章,利用小鼠孤雄单倍体胚胎干细胞 (Androgenetic haploid embryonic stem cells, AG-haESCs,又称为“人造精子细胞”) 介导的半克隆技术揭示了雄性配子基因组中两个重要的印记调控区域 (H19-DMR 和 IG-DMR)在出生前胚胎发育过程中的时序调控功能,同时发现敲除H19H19-DMR和IG-DMR的AG-haESCs可以更加高效地支持半克隆胚胎的发育。
 
        20世纪80年代,科学家们通过研究单亲胚胎(孤雄或者孤雌)的发育,发现父本和母本的基因组存在差异表达基因,且不可以相互替代,并将这种亲本差异表达基因定义为印记基因。印记基因的差异表达通常受亲本基因组上的差异甲基化区域 (Differential DNA methylation region, DMR)调控,其中两个较早发现的DMR区域(H19-DMR和IG-DMR)在父源基因组上的甲基化修饰,调控这两个印记区域中H19Igf2Gtl2Dlk1Dio3等印记基因的表达。大量研究显示H19-DMR和IG-DMR在胚胎发育中起到重要的作用,但是,二者是如何协同调控胚胎的发育却一直没有被阐释。
 
        2012年,李劲松研究组建立了小鼠的孤雄单倍体胚胎干细胞,并证明这些细胞能够代替精子使卵母细胞“受精”产生半克隆小鼠(Yang et al., 2012)。然而,半克隆胚胎的发育率低。进一步研究发现,孤雄单倍体胚胎干细胞中H19-DMR和IG-DMR的甲基化丢失,同时,发育异常的半克隆胚胎也存在H19-DMR和IG-DMR的甲基化丢失;通过删除孤雄单倍体胚胎干细胞的H19-DMR和IG-DMR模拟该区域的甲基化状态,使得半克隆小鼠出生效率提高了10倍。因此,携带H19-DMR和IG-DMR敲除的单倍体细胞又被称为“人造精子细胞”(Zhong C et al., 2015)。这些结果提示“人造精子细胞”可以作为非常理想的材料去研究印记调控区域对于胚胎发育的影响。
 
        在本研究中,研究人员首先比较了来源于野生型(wild-type, WT)和DKO (H19-DMR and IG-DMR double knock-out) 单倍体胚胎干细胞的半克隆胚胎的体外发育效率以及半克隆囊胚的转录组,发现两者并没有显著差异。具体分析发现,受H19-DMR和IG-DMR调控的H19Igf2Gtl2Dlk1等印记基因在着床前胚胎中的表达水平低,而着床后随着发育的进程表达量不断增加,因此DKO没有对着床前胚胎发生明显作用。
 
        研究人员进一步将WT和DKO的半克隆胚胎移植到受体母鼠子宫内,并从胚胎期6.5天(E6.5)到E12.5天每天解剖观察胚胎的发育状况,发现DKO半克隆胚胎的着床率高于WT。另外,在E12.5,DKO的发育率显著高于WT。WT的半克隆胚胎从E9.5往后异常发育率不断增加,胎儿不断出现发育阻滞和死亡;而DKO半克隆胚胎的发育缺陷出现在E10.5前,之后,大部分胚胎可以正常发育到期。组织学分析发现,WT半克隆胚胎发育异常的主要原因是胎盘和脐带发育异常导致的胎儿与母体间物质交换受阻,而DKO回补了WT胚胎中异常表达的印记基因,并明显改善了胎盘发育的异常。
 
        有意思的是,甲基化分析发现异常发育WT半克隆胚胎在E12.5均出现H19-DMR甲基化的擦除,而IG-DMR甲基化擦除存在于异常和正常的胎儿中,暗示着H19-DMR甲基化的正常维持对于半克隆胚胎前半程发育至关重要而IG-DMR的作用不大。为了研究H19-DMR和IG-DMR如何协同发挥功能,研究人员建立了只携带IG-DMR敲除的单倍体细胞,发现来源于这些细胞的半克隆胚胎发育率低,且不能发育到期;另外,大部分胚胎在E12.5前发育失败,且出现H19-DMR甲基化的丢失,这些结果显示IG-DMR在胚胎发育的前半程并没有发挥显著作用。
 
        之前的研究显示H19-DMR敲除的单倍体细胞能显著改善半克隆胚胎E12.5的发育效率(Zhong C et al., 2015),然而,H19-DMR敲除并不能模拟父源H19完全失活的状态。因此,研究人员在单倍体细胞中敲除H19-13kb (包括H19和H19-DMR)以实现父源H19完全不表达,发现,E12.5胚胎的发育状态较好,与DKO的半克隆胚胎类似。此外,通过转录组分析发现H19Δ13kb和DKO的半克隆胎盘与正常的ICSI的胎盘类似,显著好于WT和IGΔDMR的胎盘。然而,只敲除H19-13kb的半克隆胚胎在E18.5时期出现了大量发育阻滞和退化的胚胎,这些胎儿的IG-DMR的甲基化均出现部分或完全的擦除,说明IG-DMR在胚胎发育的后期具有重要调控作用。最后,研究人员在H19-13kb敲除单倍体细胞中再敲除IG-DMR纠正了H19Δ13kb胚胎后半程发育异常的状态,从而获得优于DKO单倍体细胞支持半克隆胚胎发育能力。
 
       综上,该研究利用单倍体细胞介导的半克隆技术,揭示了父源印记调控区域 (H19-DMR和IG-DMR) 在胚胎发育过程中的时序调控作用;同时,该研究显示“人造精子细胞”介导的半克隆技术是研究胚胎发育印记调控的有效工具。同期“SCIENCE CHINA Life Sciences”杂志刊发了上海科技大学李夏军教授的专评文章,充分肯定了“人造精子细胞”介导的半克隆技术在印记的胚胎发育调控研究中的作用,并开创性地回答了父系印记区Igf2-H19Dlk1-Dio3在小鼠的产前胚胎发育调控中的时序作用。
 
        该研究在李劲松研究员的指导下,由博士研究生李庆,博士后李元元,尹奇和王凯,以及上海科技大学的博士研究生黄硕等共同完成。该工作得到了中国科学院、国家科技部、国家基金委和上海市科委经费的支持。李劲松研究员受到中国科学院大学臻溪生命科学基金的支持,该研究还得到了分子细胞中心GTP(基因组标签计划)中心、细胞生物学技术平台和动物实验技术平台的支持。
 
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父性印记调控区H19-DMR和IG-DMR在出生前胚胎发育过程中的时序调控功能

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